使用超高效合相色谱(UPC²)对市售制备级生物柴油进行分析方法优化

市售生物柴油通常是以甲醇或乙醇为反应物，与植物油进行酯交换制备而得。产物为脂肪酸甲酯(FAME)或脂肪酸乙酯(FAEE)。生物柴油作为一种能源，需符合特定标准。例如，三酰甘油、甘油二酯、单酰甘油和游离甘油等酰基甘油类杂质的含量应介于0.2%-0.8%，甘油含量应为0.02%。

生物柴油杂质分析的标准操作规程通常涉及气相色谱(GC)，但该方法必须借助高温(370 ℃)或柱前衍生将分析物转换为挥发性较强的产物才能成功完成分析。高温GC所需条件通常比较苛刻，这会导致某些分析物发生降解和/或重排。此外，衍生化通常需要多个步骤来制备样品，非常耗时。

超高效合相色谱 (UPC²)是一种创新型技术，它将UPLC的性能优势充分应用到超临界流体色谱(SFC)中。UPC²作为一种与反相液相色谱(RPLC)正交的分析技术，可与超临界CO₂和亚2 μm颗粒色谱柱结合使用，用于解决常规LC或GC分析遇到的众多分离难题。

本文所介绍的分析方法可用于分析以烟草籽油为原料的一系列自制生物柴油2和市售B100生物柴油。另外，为得到更加纯净的生物柴油，研究中使用装填有未键合硅胶的成品玻璃色谱柱通过重力自流对自制的合成生物柴油进行了简单纯化，并使用己烷和乙醇作为混合洗脱液。

实验条件

系统： ACQUITY UPC²

色谱柱： ACQUITY UPC² HSS C18 SB, 1.8 μm, 3.0 x 150 mm

结果与讨论

图1所示为加入C18三酰甘油、甘油二酯和单酰甘油以及游离甘油混合物的模拟生物柴油分离结果，模拟生物柴油成分为FAEE混合物。实验采用不同梯度洗脱曲线和流速以期更快完成分析，从而最大限度降低所有杂质的分离度损失。图1方法A在先前的一份应用纪要中原本用于开发分离方法。此方法的分析时间为17分钟，但为了缩短分析时间，本研究调整了初始流速以及改性剂的起始和结束浓度，以便在10 min内完成所有化合物的分离工作(图1-方法B)。最终，梯度时间得到了进一步缩短，从而使得分析用时少于5 min并且保证所有杂质具有足够的分离度。因此，方法C适用于分析杂质含量相对较少的生物柴油。

但由于样品中含有来源于烟草籽油的高浓度合成生物柴油，并且各种三酰基甘油的洗脱峰因与生物柴油峰尾邻近而可能干扰定量，所以后续分析将采用第二种方法(方法B)。在不损失分离度的情况下获得更快分析速度的方法意味着产品质量监测过程中能够实现更高的样品通量。

图1.UPC²单次进样模拟生物柴油、甘油以及C18酰基甘油的混合物(不同梯度)。

因此，采用方法B来确定以三批烟草籽油为原料自制合成的生物柴油纯度(图2)。如图所示，三种生物柴油样品中均存在多种杂质(保留时间窗口为2-4 min)以及保留时间为6.2 min的单酰甘油。

批次2样品中的总杂质量最多，批次3最少。为进行比较，本研究还选取了市售的B100生物柴油样品进行分析(图3A)。如图所示，根据保留时间结果，市售B100生物柴油中同样检测出了单酰甘油。在2-4 min保留时间窗口中发现了其他杂质，但未对其进行鉴定。图3B所示为加入不同已知杂质(用于进行比较)的模拟生物柴油(即，预混合FAEE)的分离结果。

图2. 三个不同批次烟草籽油源生物柴油的UPC²色谱图。

图3. 使用市售生物柴油B100和加有不同杂质的模拟生物柴油混合物执行进样。

对于生产商和行业来说，生产出不含甘油或酰基甘油的纯生物柴油非常重要，但前提是去除杂质的方法经济有效。目前业内通常利用密度差异来分离大部分甘油杂质。本应用中，我们开发出一种仅需两步操作的简单柱色谱工艺，该工艺能够去除合成生物柴油中包括甘油在内的所有杂质。具体来说，就是让烟草籽油源生物柴油和相关杂质通过装填有未键合硅胶的色谱柱，然后先通过重力洗脱，再先后使用己烷和乙醇洗脱。

随后对所有组分进行蒸发浓缩，然后将样品溶于MeOH/DCM(1:1)。采用UPC²法进行组分分析，如图1B所示。图4所示为纯化前合成生物柴油的分离结果、己烷洗脱纯化后的分离结果以及乙醇洗脱纯化后的分离结果。如图所示，通过己烷提取物得到的合成生物柴油已近乎纯净。各生物柴油样品的乙醇洗脱物中分离并检出了在相同保留时间窗口中洗脱的单酰甘油类洗脱峰。该纯化工艺应该能够适用于需要得到纯净生物柴油(FAEE或FAME)的工业生产。使用方法C时，可利用UPC²在五分钟内轻松检出样品中的杂质。UPC²能够直接接受己烷和乙醇提取物进样，从而实现了生物柴油杂质的快速评估。

图4. 使用市售生物柴油B100和加有不同杂质的模拟生物柴油混合物执行进样。

结论

本研究成功使用一根装填有1.8 μm颗粒的ACQUITY UPC² HSS C18 SB色谱柱完成了甘油、酰基甘油和FAEE混合物(即模拟生物柴油)的分离工作。使用梯度CO₂和乙腈/甲醇作为流动相并通过ELS进行检测，优化后的方法能够快速分离并检测到生物柴油中的所有杂质，且无需进行样品衍生化或前处理。本研究中使用该方法检测了源自烟草籽油的三种不同合成生物柴油和一种市售生物柴油中的杂质，通过简单的两步柱色谱法(装填未键合硅胶)即可获得近乎纯净的生物柴油组分。UPC²可在五分钟内确定该等级生物柴油的纯度。