手性药物的对映体理化性质极其相似,而药理、毒理作用常常存在显著差异,因此探索提高对映体分离性能的创新策略对手性分离具有重要意义。以往关于毛细管电泳(CE)中β-受体阻断药美托洛尔(MET)对映体分离的研究主要集中在仅添加手性选择剂环糊精(CD)及其衍生物,而对于在CD的基础上添加辅助添加剂的研究较少。本研究将3种深共晶溶剂(DESs)氯化胆碱-葡萄糖、氯化胆碱-果糖和乳酸-葡萄糖作为辅助添加剂,用于MET的CE手性分离,推测了DES对基于CD的毛细管电泳分离MET对映体的协同作用。首先考察了CD种类、CD浓度、缓冲液pH值和缓冲液浓度对MET分离的影响,优化得到了最优条件(15 mmol/L羧甲基-β-环糊精、pH=3.0、40 mmol/L磷酸盐缓冲液)。其次制备了3种DESs作为添加剂,研究不同DESs及其质量分数对手性分离的作用,最终确定了最佳条件:采用质量分数1.5%的氯化胆碱-果糖型DES,此时MET的分离度从不添加DES时的1.30提升至2.61,实现了基线分离。最后对分离效果以及机理进行了推测。本文所建立的MET对映体手性分离分析方法不仅对提高手性药物质量、保证临床用药安全有效具有重要意义,还有助于将DES协同用于CD衍生物毛细管电泳手性分离的进一步研究与发展。
DESs的制备
采用混合后加热的方法制备了3种不同的DESs。使用分析天平精密称取一定量的氯化胆碱(ChCl)、葡萄糖(DG)、果糖(DF),使用移液枪吸取适量乳酸(LA),分别按照ChCl(2.000 g)∶DG(2.839 g)=1∶1、ChCl(2.000 g)∶DF(2.581 g)=1∶1、LA(2 mL)∶DG(1.064 g)=5∶1的物质的量之比在50 mL圆底烧瓶中混合,于80 ℃水浴中加热3 h,直至得到均一透明的液体。冷却至室温后,将DESs封装于阴凉处保存。
溶液配制
用H3PO4调节pH配制一系列浓度和酸度的NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液,分别向其中加入一定量的羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)、羧甲基-β-环糊精(CM-β-CD)、2,6-二-O-甲基-β-环糊精(DM-β-CD)和各类型DESs制备运行缓冲液,经0.25 μm微孔滤膜过滤后备用。
精密称取酒石酸美托洛尔标准品适量,用超纯水溶解并制成浓度为30 mmol/L的储备液,于4 ℃冰箱密封保存备用。精密量取储备液适量,用含各类CD衍生物和DESs的运行缓冲液稀释成3.0 mmol/L,经0.25 μm微孔滤膜过滤后,得到MET样品溶液。
CE的条件与方法
使用外径365 μm、内径50 μm、总长度50 cm、有效长度41.5 cm未涂覆的熔融石英毛细管,毛细管柱首次使用前用甲醇冲洗10 min, 1.0 mol/L NaOH冲洗2 h以进行活化。每次电泳运行之间,将毛细管依次用0.1 mol/L HCl、水、0.1 mol/L NaOH和运行缓冲液分别冲洗60 s以提高重复性。所有操作均在20 ℃下进行,进样方式选择压力进样5 s, 3000 Pa,运行电压均为25 kV,紫外检测波长为230 nm。优化后的缓冲液条件如下:15 mmol/L CM-β-CD, pH=3.0, 40 mmol/L磷酸盐缓冲液,1.5% ChCl-DF。
结论
本文研究了DESs作为添加剂对毛细管电泳手性分离MET的影响。实验证明,DESs可以提高MET消旋体的分离效率。DESs能够提高毛细管电泳手性分离效率的可能原因如下:(1)DESs加入缓冲液后,离子强度会随之增加,使分离度得到提升。(2)DESs对CD和对映体具有挤压效应,可以提高CD的包合能力,对映体进入CD腔体的程度增加,从而提高分离度。今后,可结合计算化学的分子对接技术,进一步探索DESs作为添加剂改善毛细管电泳手性分离的机理。
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